Il Museo custodisce ed espone una collezione di sculture, bassorilievi e mosaici antichi, nonché dipinti e sculture dal XV al XIX secolo. Tra i capolavori della raccolta, il cui primo e più importante nucleo risale al collezionismo del cardinale Scipione Borghese (1579-1633), nipote di Papa Paolo V, ci sono opere di Caravaggio, Raffaello, Tiziano, Correggio, Antonello da Messina, Giovanni Bellini e le sculture di Gian Lorenzo Bernini e del Canova.

Le opere sono esposte nelle 20 sale affrescate che, insieme con il portico e il Salone di ingresso, costituiscono gli ambienti del Museo aperti al pubblico. Inoltre, oltre 260 dipinti sono custoditi nei Depositi della Galleria Borghese, collocati sopra il piano della Pinacoteca e allestiti come una quadreria (sono visitabili su prenotazione).