In diesem Video werden wir uns mit der Polymerase-Kettenreaktion (oder kurz: PCR) beschäftigen, einem Verfahren, mit Hilfe dessen man von spezifischen, kurzen DNA-Abschnitten zahlreiche Kopien anfertigen kann. (Die Vervielfältigung der DNA bezeichnet man auch als DNA Amplifikation.)
Wahrscheinlich habt ihr euch schon mit der DNA-Replikation beschäftigt, also der Verdopplung der DNA. Die DNA, in der unsere Erbinformation gespeichert ist, nennt man auch eine Doppelhelix, weil sie aus zwei Einzelsträngen besteht, die wie eine Schraube um ihre eigene Achse gewunden sind. Verdopplung heißt also konkret, dass aus einem doppelsträngiem DNA-Strang zwei Doppelstränge DNA werden. Bei diesem Vorgang bleibt die DNA jeweils zur Hälfte erhalten (was man auch als semikonservativ bezeichnet). Zu jeder Hälfte wird entsprechend ein neuer Strang synthetisiert bzw. hergestellt.
Warum erzähle ich etwas über die DNA-Replikation, wenn es in diesem Video um die PCR geht? Ganz einfach - weil genau dieses Wissen um den molekularen Ablauf der DNA-Replikation sich Biologen zunutze gemacht haben, um im Labor die Polymerasekettenreaktion zu entwickeln. Die PCR beruht also auf den Mechanismus der Replikation - die PCR ahmt also den Mechanismus der Replikation nach, wie ihr später sehen werdet.
Bei der PCR wiederholen sich folgende drei Schritte zyklisch:
1) DNA-Denaturierung, 2) Primer-Hybridisierung bzw. Primer-Annealing und 3) DNA-Polymerisation.
Beim ersten Schritt, den man als DNA-Denaturierung bezeichnet, wird das Reaktionsgemisch mit den gerade genannten Bestandteilen auf ca. 92°C erhitzt. Vielleicht hat es der ein oder andere von euch bereits gemerkt: Auch wenn das PCR-Gemisch viele Bestandteile der DNA-Replikation enthält - Die Enzyme zur Entspiralisierung und Trennung des Doppelstrangs in zwei Einzelstränge tauchen nicht auf - und trotzdem ist dieser Schritt notwendig für die spätere Synthese der beiden Tochterstränge. Die Enzyme sind deshalb nicht notwendig, weil das Erhitzen des Reaktionsgemisches ihre Funktion übernimmt. Eine derart heiße Temperatur hat zur Folge, dass sich die Wasserstoffbrücken des DNA-Doppelstrangs - der DNA-Matrize - lösen und auf diese Weise die beiden Stränge getrennt werden. Wenn man das gesamte Gefäß erhitzt, ist klar, dass alle Bestandteile dieser heißen Temperatur ausgesetzt sind - und vor allem für die DNA-Polymerase stellt das ein echtes Problem dar, weil diese bei Temperaturen nahe des Siedepunktes.denaturiert - also kaputt geht.
Als die PCR-Methode erfunden wurde, musste man in jedem Zyklus nach der Denaturierung ein neues Enzym DNA-Polymerase hinzufügen, sodass die Methode kaum geeignet war für eine allgemeine, breite Anwendung. Deutlich wirtschaftlicher und praktikabler wäre es, ein Enzym zu verwenden, das selbst bei der Denaturierungstemperatur von über 90°C funktionsfähig bliebe, sodass es nicht bei jedem Zyklus neu zugeführt werden muss. Die Lösung für dieses Problem stellt das Bakterium Thermus aquaticus dar, das in heißen Quellen lebt. Entsprechend seiner heißen Umgebungstemperatur hat es einen äußerst hitzeresistenten Stoffwechsel - und zu diesem gehören auch Enzyme wie die DNA-Polymerase, die bei solch hohen Temperaturen nicht denaturiert. Aus diesem Grund nutzt man die hitzeresistente DNA-Polymerase von Thermus aquaticus, die bei den hohen Temperaturen während der Denaturierung der DNA intakt bleibt.
Beim zweiten Schritt, der sogenannten Primerhybridisierung bzw. dem primer annealing wird das Reaktionsgefäß auf ca. 50-60°C abgekühlt, sodass sich die DNA-Primer an die Matrizenstränge durch komplementäre Basenpaarung anlagern können. Anders als bei der Replikation der DNA handelt es sich bei der PCR um DNA- anstatt RNA-Primer. Damit man komplementäre Primer, die jeweils am Ende jedes Strangs binden, künstlich herstellen kann, muss natürlich die jeweilige Basensequenz am Ende beider Stränge bekannt sein.
Eine Polymerase eines Bakteriums, das in heißen Quellen lebt, ist nicht nur hitzeresistenter und kann höhere Temperaturen überleben - es arbeitet natürlich auch bei deutlich wärmeren Temperaturen als die DNA-Polymerase beispielsweise von uns Menschen. Deshalb wird die Temperatur beim nächsten Schritt, bei der sogenannten Polymerisation, erhöht auf eine für die DNA-Polymerase optimale Temperatur, nämlich auf ca. 74°C. Bei dieser Temperatur lagern sich die DNA-Polymerasen an die Primer der beiden Matrizenstränge an und katalysieren die Synthese der neuen komplementären Stränge.
Nach diesen drei Schritten - Denaturierung - Annealing - Polymerisation - sind mittels PCR aus der Matrizen-DNA zwei doppelsträngige Kopien der DNA-Sequenz hervorgegangen. Ein einzelner Zyklus dauert nur wenige Minuten - man kann sich leicht vorstellen, wie in kurzer Zeit eine enorme Menge an Kopien des gewünschten DNA-Fragments erzeugt werden können - schließlich nimmt die Anzahl der Kopien mit der Wiederholung des Zyklus exponentiell zu.